文/乌鲁木齐海关    蒋晓玲  姚武  李飞图 /乌鲁木齐海关    蒋晓玲

向日葵是全球五大油料作物之一。在我国油料作物中，向日葵的种植面积呈逐年增大的趋势，其病害也随之日益严重。向日葵黑茎病于20世纪50年代首次发现于加拿大，现分布于美国、加拿大、阿根廷、俄罗斯、东欧、法国、意大利、澳大利亚、伊朗、伊拉克、巴基斯坦、斯里兰卡等地。我国历史上没有向日葵黑茎病发生，但2005年首次在新疆伊犁发现，是一种新病害，2010年被原农业部增补为我国进境植物检疫性有害生物。

该病自发生以来呈不断蔓延之势，对新疆向日葵产业构成了严重的威胁。新疆吉木乃口岸、阿拉山口口岸、巴克图口岸等地均从哈萨克斯坦进口向日葵，一定程度上增加了向日葵黑茎病在我国扩散的风险。为防止病害扩散，在向日葵进口后，海关工作人员会根据风险系统布控结果对其进行采样，采集的样品将会被送往实验室进行检测，检测项目包括向日葵黑茎病、杂草、铅、汞等。本文将着重介绍向日葵黑茎病的检测方法。

向日葵黑茎病的症状及危害

向日葵黑茎病是一种毁灭性真菌病害，病株茎杆、叶柄、叶片、花盘等被侵染，早期发病植株枯死倒伏，发病较晚的矮化瘦弱，花盘小，种子产量和含油率剧降，严重时导致植株大面积枯萎死亡。病原菌可侵染地下、地上各器官，全生育期发病，但前期症状不明显，易被忽视，开花期后的茎杆发病较为明显，可以此作为诊断依据。向日葵黑茎病会在茎杆上生成典型的大型病斑，呈黑色椭圆形，长2～11厘米（多数长5～7厘米），有光泽，具清晰的边缘，病斑扩展后可环绕茎杆。茎杆病斑多见于茎杆中部，但也可能全部变黑。茎杆发病处腐烂，内部组织解离，多弯折倒伏。后期发病茎杆表面产生黑色小粒点，即病原菌的分生孢子器，肉眼无法清楚看到，需用手持放大镜观察。田间检查表明，多数茎杆发病源于叶柄发病，在叶柄基部形成黑色病斑，扩展后从叶柄蔓延到茎杆，同时整个叶柄变黑坏死，叶片枯萎。有时，叶片上也会形成大型病斑，呈黑色，周围变黄，病斑上有不甚明显的环纹，系病斑不断扩展所致。花盘背面和苞片也会产生褐色至黑色病斑，形状不规则，严重时花盘干枯，籽粒不实。

向日葵黑茎病菌的检测方法

平板检测法

◎病菌分离

从向日葵中挑选干瘪、弱小、畸形的可疑病种子和植株残体（茎杆、叶柄、花盘）作为实验材料。将挑选出的植株残体剪成0.4cm×0.4cm小块，用纱布包好，同时将整粒可疑种子用纱布包好。在超净工作台中分别放入1.0％的次氯酸钠溶液中，消毒5分钟，用灭菌水冲洗3次，种子于无菌条件下25℃保湿放置24小时，再在-20℃下冰冻24小时后培养；对于经表面消毒后的植株残体，则用灭菌滤纸吸干水分后直接培养。

将处理后的实验材料置于酸性马铃薯（APDA）选择性培养基平板上，每个皿放置3～4块，在25℃和12小时光照、黑暗交替的条件下培养。培养3天后开始观察，发现乳白色或白色可疑菌落，立即用APDA进行平板划线分离纯化。记录菌落培养性状，包括菌落生长速度、颜色和形状等。

◎菌落鉴定特征

培养5天左右，分离组织上出现的白色菌落；培养7天后，菌落中产生病菌分生孢子器。APDA上的菌落呈乳白色、象牙色或浅灰黑色，菌落边缘不整齐，生长较缓慢，生长速度为4～5mm/天，气生菌丝绒毛状或絮状，培养皿背面初为象牙色或浅黄色，老熟后呈黄褐色或灰黑色。

被黑茎病菌感染的向日葵病体。

培养出的菌落。

分子生物学检测法

目前实验室常用的鉴定方法为分子生物学检测方法，具体可以分为以下四步：

第一步

利用植物组织基因提取试剂盒对病变葵花籽种子及植株残体中黑茎病菌的DNA进行提取。

第二步

配制PCR反应体系，于PCR仪中进行扩增（采用ITS1/ITS4引物，目标片段为580bp）。

第三步

制作1.5%琼脂糖凝胶（加入EB染色液），将扩增产物于含有1×TAE缓冲液的电泳仪中电泳（120伏，120毫安，电泳20～30分钟）。

第四步

在凝胶成像系统中观察目标条带，如有目标片段大小的单带出现，则将扩增产物进行序列测定。将测序获得的序列与NCBI网站GenBank中相关序列进行同源性比对分析，同源性为99%～100%，可鉴定为向日葵黑茎病菌。