文 / 林萍萍 安鹏天 史云鹏

近年来，随着我国畜牧业的快速发展，国内对优良种畜资源的需求也日益强烈，进境种牛对于品种改良，优化我国牛类种质资源，丰富种牛基因等具有积极意义。但是，大量优质种畜的引进，在促进我国养殖业和经济贸易发展的同时，也增加了动物疫病传入我国的风险。为此，加强进境种牛检验检疫和监管已成为口岸动物检疫面临的重要课题，对有效防控动物疫情、保护农林畜牧业发展、守护国门生物安全、维护社会稳定具有重要意义。本文将对与进境种牛检疫相关的事项进行介绍。

进境种牛检疫项目

目前，我国进境种牛主要来源于澳大利亚、新西兰、乌拉圭、智利四国。从不同来源国进口的种牛须检疫的疫病也不尽相同，根据中国和其他国家政府之间有关的动植物检疫双边议定书要求，澳大利亚进口种牛须检疫重点疫病4种：蓝舌病、牛病毒性腹泻、副结核病、赤羽病；一般疫病2种：牛白血病和鹿流行性出血热；潜在风险疫病3种：施马伦贝格、布鲁氏菌病和结核病。新西兰进口种牛须检疫重点疫病3种：结核病、副结核病、牛病毒性腹泻；一般疫病2种：牛白血病和牛支原体病；潜在风险疫病2种：施马伦贝格和布鲁氏菌病。乌拉圭进口种牛须检疫重点疫病5种：口蹄疫、结核病、布鲁氏菌病、牛白血病和牛病毒性腹泻；一般疫病1种：副结核病；潜在风险疫病2种：施马伦贝格和Q热。智利进口种牛须检疫重点疫病4种：牛病毒性腹泻、牛白血病、布鲁氏菌病和结核病；一般疫病1种：副结核病；潜在风险疫病1种：施马伦贝格。

进境种牛查验要点

口岸现场检疫（锚地检疫）

对运输工具、场地、装卸工具等进行严格消毒，运载种牛的运输工具抵达入境口岸后，海关人员登轮检疫，对进境种牛进行全面地临床检查、核对种牛耳标信息、检查运输日志和输出国家官方检疫证书等，并对运输工具消杀情况进行监督。经锚地检疫合格后，立即装车。按照预定路线进行隔离场转运，转运过程中海关关员全程押运。

隔离检疫

隔离场不能同时隔离检疫两批动物。在动物进入隔离场前10天，全场进行3次消毒，每次间隔3天，在动物进场前1天结束消毒。进境种牛的隔离检疫期为45天，在隔离期间，海关关员须双人24小时驻场监管，并根据《进境动物隔离检疫场使用监督管理办法》等相关要求，开展活牛体温监测、血样采集、实验室检测等一系列检疫监管工作。

采样及实验室检测

一般情况下，在进境种牛入场7天内，由海关关员负责完成样品采集、送检工作，样品送具有资质的海关实验室进行检测。

检疫处理及出证

根据现场检疫、隔离检疫和实验室检疫的结果，对符合议定书或协定规定的进境种牛出具《入境货物检验检疫合格证明》。检出《中华人民共和国进境动物疫病名录》中一类传染病的，阳性动物及同群动物禁止入境，作退回或销毁处理；检出二类疾病的，阳性动物禁止入境，作退回或销毁处理，同群的其他动物放行。后续将继续跟踪了解种牛进入牧场后的饲养管理和疫情疫病情况。

进境种牛检疫方法

酶联免疫（Enzyme-linked immunosorbnet assay，ELISA）是把抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用有机结合起来的一种检测技术，原理是抗原或抗体吸附于固相载体进行免疫酶反应，经底物显色后用酶标仪进行检测，由于待测谱物的含量与呈色物质的颜色具有相关性，因此可以通过颜色的不同来达到定性定量分析待测样品之目的。由于ELISA具有操作简单、灵敏度高和特异性高等特点，并且适合批量样品检测，因此被广泛应用于口岸进境种牛疫病检测。

样品采集

待检样品的质量是确保实验结果准确性的重要因素，因此样品要求新鲜和纯净。种牛疫病ELISA实验一般采用种牛血清进行检测。进境种牛的抽批比例为100%，每批逐头采样，采样时间原则上是动物进入指定隔离检疫场所7天内完成。根据检测不同种类疫病所需样品量不同，所采血液样品量至少为7mL，并在整个采血过程中尽量避免反复颠倒，严防样品溶血的产生。

样品处理

分离血清还需注意的是，分离血清时要核对好样品编号，样品一式两份，一份待检样品，一份留样保存，血清可冷藏自然析出，也可离心析出，但需控制离心的速度和时间，因过度离心会造成红细胞破裂，进而影响实验结果。

样品ELISA检测

目前，口岸种牛疫病检测常用的试剂盒由不同厂家生产，所采用的方法各不相同，这就给温育温度、温育时间、洗板次数等带来了不同，但大致的实验步骤相同，具体如下：

加样：按试剂盒说明书加入一定量的阴阳性对照样品及稀释的待检样品，封板混匀，按照要求的温度时间进行温育，然后洗涤。

加酶标抗体：在各反应孔中加入新鲜配置的酶标抗体，封板，按要求的温度时间进行孵育，然后洗涤。

加底物溶液显色：在各反应孔中加入底物溶液，按要求的温度时间避光孵育。

终止反应：在各反应孔中加入终止液，终止反应。

读取结果及结果判定：在酶标仪的450nm波长处读取结果。按试剂盒中提供的公式进行计算，并打印纸质结果。

总体来看，ELISA检测步骤看似简单，但在实验操作过程中，很多因素（如血清样品处理、移液器使用不当、酶标洗板的彻底程度等）都将会影响检测结果的准确性，导致出现一些假阳性或假阴性，因此，实验室应从以下方面进行把控：

一是保证实验室环境设施和仪器设备处于良好状态；二是实验涉及的试剂及检测方法必须标准化，及时更新检测标准和技术规范；三是实验技术人员须定期培训，加强业务学习，提高专业技能，严格按照实验室规章要求进行样品的检测，在实践中对ELISA实验中的关键环节进行探索和优化，认真避免或减少影响因素，尽量避免假阳性和假阴性结果的出现，提升口岸动物疫病的检验检疫技术水平，确保数据准确可靠，从而保障国内养殖业健康和可持续发展。

（作者单位：石家庄海关所属黄骅港海关）

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